Malonato-Brühe: Grundierung, Zubereitung und Verwendung

Die Malonatbrühe ist das flüssige Kulturmedium, das für den diagnostischen Test (Malonato-Test) verwendet wird, um einige Gattungen der Familie Enterobacteriaceae zu unterscheiden. Es wurde 1933 von Leifson kreiert und anschließend von Ewing modifiziert, der der ursprünglichen Rezeptur eine kleine Menge Dextrose und Hefeextrakt beigemischt hatte.

Das Medium besteht derzeit aus Hefeextrakt, Ammoniumsulfat, Dikaliumphosphat, Monokaliumphosphat, Natriumchlorid, Natriummalonat, Dextrose und Bromthymolblau. Dieser Test ist normalerweise in der biochemischen Identifizierungsbatterie für Enterobakterien enthalten und hilft, bestimmte Gattungen und Arten zu unterscheiden.

Der Malonattest basiert hauptsächlich auf der Fähigkeit einiger Mikroorganismen, Natriummalonat als einzige Kohlenstoffquelle und Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle zu verwenden.

Der Malonattest ist in der Regel bei einigen Arten der Gattungen Enterobacter, Klebsiella und Citrobacter positiv. Die meisten Arten der Gattungen Escherichia, Salmonella, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus und Providence reagieren dagegen negativ.

Stiftung

Der Malonattest besteht aus dem Nachweis derjenigen Bakterien, die in der Lage sind, Natriummalonat als einzige Kohlenstoffquelle und Ammoniumsulfat als Stickstoffquelle zu verwenden.

Die Mehrheit der Enterobakterien, die kein Malonat verwenden, können in diesem Medium wachsen, indem sie Dextrose und Hefeextrakt als Nährstoffe verwenden.

In diesem Fall wird jeglichem Alkalisierungsversuch unter Verwendung der Peptonen durch die Produktion von Säuren entgegengewirkt, die durch die Fermentation der Dextrose erzeugt werden. Ebenso wirken Dikalium- und Monokaliumphosphate als Puffer, der den pH-Wert bei 6, 7 hält.

Wenn der Test negativ ist, hat die Brühe dieselbe ursprüngliche Farbe (grün). In seltenen Fällen konnte das Medium aufgrund der Fermentation von Dextrose angesäuert werden. ohne die Verwendung der Peptonen und des pH-Indikators würde sich die Farbe des Mediums in Richtung Gelb ändern. Dazu muss der pH-Wert auf 6 fallen.

Wenn dieser Test positiv ist, wird gesagt, dass der Mikroorganismus Malonat und Ammoniumsulfat als Kohlenstoff- bzw. Stickstoffquellen verwendete, ohne die anderen Komponenten zu verwenden.

In diesem Fall wird das Medium aufgrund der Freisetzung von Natrium und der daraus resultierenden Bildung von NaOH alkalisch. In diesem Sinne ändert der pH-Indikator (Bromthymolblau) die Farbe von grün nach blau, wenn der pH-Wert gleich oder größer als 7, 6 ist. Das Blau kann klar oder intensiv sein (preußisches Blau).

Schließlich behält Natriumchlorid die Osmolarität des Mediums bei und Wasser ist das Verdünnungsmittel aller Komponenten.

Interpretation

Brühe der gleichen Farbe (grün): negativer Test

Gelbe Brühe: negativer Test

Hellblaue oder intensive Brühe: positiver Beweis

Es gibt eine Variante namens Phenylalanin-Malonat-Bouillon, die auch als Shaw- und Clarke-Medium bezeichnet wird. In diesem Fall können zwei Tests analysiert werden, die Verwendung von Malonat als Kohlenstoffquelle und die Herstellung von Brenztraubensäure aus Phenylalanin.

Vorbereitung

Malonato-Brühe

Die Menge an Gramm, die auf der Beilage des gewählten Handelshauses angegeben ist, wird gewogen (sie kann von einem zum anderen variieren). Schwere Gramm werden in einem Liter destilliertem Wasser suspendiert. Etwas erhitzen, bis sich alles vollständig aufgelöst hat. Verteilen Sie 3 ml des Mediums in 13/100 Reagenzgläsern mit einem Baumwolldeckel.

Im Autoklaven 15 oder 20 Minuten bei 121 ° C sterilisieren.

Vor Gebrauch abkühlen lassen. Wenn sie nicht sofort verwendet werden, lagern Sie sie bis zur Verwendung im Kühlschrank. Temperieren Sie die Brühen bei Raumtemperatur, bevor Sie sie beimpfen.

Der pH-Wert des Mediums sollte 6, 7 ± 0, 2 betragen. Die Farbe des zubereiteten Mediums ist flaschengrün.

Phenylalaninmalonat-Bouillon

11 g des dehydrierten Mediums werden abgewogen und in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst. Der Rest der Vorbereitung ist der gleiche wie der oben beschriebene.

Es kann auch hergestellt werden, indem 2 g / l Phenylalanin zu dem Malonatbrühenmedium gegeben werden, bevor es sterilisiert wird.

Verwenden Sie

Es wird als Teil der Batterie von biochemischen Tests verwendet, die zur Identifizierung von Bakterien der Familie Enterobacteriaceae zusammengestellt werden.

Hilfe bei der Unterscheidung zwischen:

-Die Gattung Klebsiella und Enterobacter (+) der Gattungen Escherichia und Serratia (-).

-Die Arten Salmonella enterica ssp arizonae, Salmonella enterica ssp salame und Salmonella enterica ssp diarizonae (+) der Art Salmonella enterica ssp enterica (-).

-Aus der Gattung Klebsiella allgemein (+) der Gattung Actinobacillus (-).

-Es kann manchmal bei der Unterscheidung von Gattungen und Arten von Bakterien helfen, die nicht zur Familie der Enterobacteriaceae gehören, z. B. zwischen den nicht fermentierenden gramnegativen Bazillen Alcaligenes faecalis (+) und Acinetobacter sp (-).

Vorgehensweise

Unter einem Feuerzeug wird eine Portion einer reinen Kolonie entnommen, wobei ein ordnungsgemäß sterilisierter und gekühlter Platingriff verwendet wird. Die entnommene Probe (leichtes Inokulum) wird in der Malonatbrühe gelöst. Es wird mit dem losen Deckel in Aerobiose bei 35 ° C ± 0, 2 für 24 bis 48 Stunden inkubiert.

Die Malonat-Bouillon kann auch aus einer Kultur von 18 bis 24 Stunden in Trypticase-Sojabouillon inokuliert werden. In diesem Fall werden 0, 01 ml mit einer sterilen Pipette entnommen und die Malonatbrühe inokuliert. Es wird mit dem losen Deckel in Aerobiose bei 35 ° C ± 0, 2 für 24 bis 48 Stunden inkubiert.

Am Ende der Zeit werden die Ergebnisse interpretiert. Alle Spuren von blauer Farbe, die nach 48-stündiger Inkubation gipfelten, sollten als positiv betrachtet werden. Der Test sollte erst nach Ablauf der Inkubationszeit von 48 Stunden als negativ interpretiert werden.

Im Falle der Verwendung der Phenylalaninmalonat-Bouillon-Variante wird Malonat zuerst interpretiert und dann werden 5 Tropfen 1 N HCl und 3-5 Tropfen Eisenchlorid 8% zugegeben. Eine dunkelgrüne Farbe wird als positiver Test für Phenylalanin interpretiert. Färbt sich das Medium hingegen hellblau, ist der Test negativ für Phenylalanin.

Qualitätskontrolle

Um die Sterilitätskontrolle des Mediums durchzuführen, sollten eine oder zwei Brühen bei 35 ° C ± 0, 2 für 24 Stunden inkubiert werden. Am Ende dieser Zeit sollte es keine Trübung, keine Farbveränderung geben.

Zur Qualitätskontrolle können bekannte oder zertifizierte Stämme verwendet werden, wie: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella enterica ssp arizonae ATCC 13314 und Escherichia coli ATCC 25922.

Die erwarteten Ergebnisse sind:

  • Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae und Salmonella enterica ssp arizonae reagieren positiv (mittelblaue Farbe).
  • Für Escherichia coli muss das Ergebnis negativ sein, dh es wird erwartet, dass sich die Farbe (grün) nicht ändert oder dass sie aufgrund der Fermentation von Glucose gelb wird.

Einschränkungen

Verwenden Sie keine Brühe, die Trübungen, Ausfällungen, Farbveränderungen oder Anzeichen einer Verschlechterung aufweist.