Katalasetest: Grundlagen, Technik und Verwendung
Der Katalasetest ist eine Methode, die in bakteriologischen Labors verwendet wird, um das Vorhandensein des Katalaseenzyms in den Bakterien nachzuweisen, die es besitzen. Neben der Gram-Färbung sind die wichtigsten Tests, die an neu isolierten Mikroorganismen durchgeführt werden sollten. Diese Tests leiten den Mikrobiologen zu den Schritten, die zur endgültigen Identifizierung des betreffenden Mikroorganismus zu befolgen sind.
Im Allgemeinen besitzen Cytochrom enthaltende Bakterien das Katalaseenzym, dh aerobe und fakultative anaerobe Bakterien sollten es besitzen. Es gibt jedoch Ausnahmen wie Streptococcus, die, obwohl sie fakultativ anaerobe Mikroorganismen sind, nicht über das Katalaseenzym verfügen.
Aus diesem Grund wird der Katalasetest hauptsächlich zur Unterscheidung der Familien Staphylococaceae und Micrococaceae (beide Katalase positiv) der Familie Streptococaceae (Katalase negativ) verwendet.
Ebenso unterscheidet sich unter anderem die Gattung Bacillus (Katalase-positiv) von der Gattung Clostridium (Katalase-negativ).
Stiftung
Katalase ist ein als Hydroperoxidase klassifiziertes Enzym, dh sie verwenden Wasserstoffperoxid (H 2 O 2 ) als Substrat.
Es wird auch als Oxidoreduktase angesehen, da bei der Reaktion ein Element als Elektronendonor (reduzierende Substanz) und ein anderes als Elektronenrezeptor (oxidierende Substanz) dient.
Katalase ist ein Protein, das eine prothetische Gruppe mit vier dreiwertigen Eisenatomen (Fe +++) enthält, daher ist es ein Homoprotein. Das Eisen (III) -Ion bleibt während der Reaktion oxidiert.
Es kann gesagt werden, dass Katalase ein entgiftendes Enzym ist, da seine Funktion darin besteht, Substanzen zu eliminieren, die während des bakteriellen Stoffwechsels gebildet werden und für Bakterien toxisch sind. Zu diesen Substanzen gehört Wasserstoffperoxid.
Wasserstoffperoxid entsteht bei der Zersetzung von Zuckern auf aerobem Weg. Dieser Vorgang läuft wie folgt ab:
Das Superoxidion (O 2 -) (freies Radikal) wird als Endprodukt der Assimilation von Glucose auf aerobem Weg gebildet. Dies ist giftig und wird durch das Enzym Superoxiddismutase beseitigt, das es in gasförmigen Sauerstoff und Wasserstoffperoxid umwandelt.
Wasserstoffperoxid ist auch giftig für Bakterien und sollte beseitigt werden. Das Katalaseenzym entfaltet Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff.
Katalase kann auf andere Substrate als Wasserstoffperoxid einwirken, wie Alkohole, Aldehyde, Säuren, aromatische Amine und Phenole. Wasserstoffperoxid kann jedoch auch von Katalase verwendet werden, um andere toxische Verbindungen wie Methyl- und Ethylalkohol zu oxidieren.
Ebenso ist Katalase in phagozytären Zellen vorhanden und schützt diese vor der toxischen Wirkung von Wasserstoffperoxid.
Routinetechnik für den Katalasetest
-Objektmethode
Materialien
3% Wasserstoffperoxid (10 Volumina).
Glas schieben
Einweg-Kunststoffgriff oder Holzstab.
Vorgehensweise
Nimm genug von der Kolonie, um zu studieren, ohne den Agar zu berühren, von dem sie stammt. Die Kolonie muss frisch sein, dh aus einer Kultur von 18 bis 24 Stunden.
Legen Sie die Kolonie auf den trockenen Objektträger und geben Sie einen Tropfen 3% iges Wasserstoffperoxid hinzu (30% H 2 O 2 kann ebenfalls verwendet werden). Beobachten Sie sofort, ob Blasen freigesetzt werden oder nicht.
Interpretation
Positive Reaktion: Gasentwicklung, erkennbar an Blasenbildung (starke Blasenbildung).
Negative Reaktion: Es kommt zu keiner Blasenbildung.
- Direktmethode in Reinkultur
1 ml 3% iges H 2 O 2 in Platten oder Keilen, die kein Blut enthalten, auf eine Reinkultur geben (vorzugsweise Nähragar). Beobachten Sie sofort, ob Blasenbildung vorliegt. Sie können auch H 2 O 2 mit 30% verwenden.
Sie wird genauso interpretiert wie die Objektportierungsmethode.
-Methode mit Kapillarrohr oder Fung und Petrishko
Füllen Sie ein 67-mm-Kapillarröhrchen in einer Höhe von 20 mm mit 3% Wasserstoffperoxid durch Kapillarwirkung.
Berühren Sie die isolierte Kolonie, die Sie untersuchen möchten, mit der Kapillare, die mit 3% H 2 O 2 gefüllt ist . Beobachten Sie, ob die Kapillare in ca. 10 Sekunden mit Blasen gefüllt ist. Mit dieser Methode kann die Reaktion in Kreuzungen halbquantifiziert werden:
Ohne Kreuze gibt es keine Blasen (negative Reaktion).
+ ---- Kleine Blasen (schwache oder verzögerte Reaktion).
++ Reichlich vorhandene Luftblasen (gemäßigte Reaktion).
+++ - Blasen erreichen das entgegengesetzte Extrem (energetische Reaktion).
-Taylor und Achanzar Methode für Katalase-Tests, die zweifelhaft sind
Auf einem sauberen, trockenen Objektträger eine isolierte Kolonie platzieren, dann einen Tropfen 0, 5% H 2 O 2 aufsetzen und mit einem Deckglas bedecken. Beobachten Sie, ob sich Blasen bilden oder nicht.
Interpretation: Das Vorhandensein von Blasen deutet auf eine positive Reaktion hin. Ohne Blasen wird es als negative Reaktion interpretiert.
Katalasetest für Mycobacterium-Arten
Diese Technik muss durch Kontrolle des pH-Werts und der Temperatur durchgeführt werden. Es muss unter einer Laminar-Flow-Haube gefahren werden, da der Umgang mit den verschiedenen Mycobacterium-Arten gefährlich ist.
-Materialien
Wasserstoffperoxid zu 30% oder 110 Volumina (Superoxal).
PH 7 Phosphatpuffer
10% Tween 80
Kultivierung von Mycobacterium wedge 3 bis 4 Wochen
-Vorbereitung von Reagenzien
PH 7 Phosphatpuffer
Wiegen:
1, 361 g wasserfreies Monokaliumphosphat (KH 2 PO 4 ).
1, 420 g wasserfreies Dinatrium (Na 2 HPO 3) phosphat.
Beide Salze in etwas sterilem destilliertem Wasser auflösen und mit Wasser auf 1000 ml auffüllen.
10% Tween 80
Machen Sie eine 1:10 Verdünnung auf den Tween 80, der im Handel erhältlich ist. Gehen Sie also wie folgt vor:
Nehmen Sie 1 ml Tween 80 und geben Sie es in ein wenig destilliertes Wasser, lösen Sie es auf und vervollständigen Sie das Volumen mit Wasser auf 10 ml.
Endgültiges Reagenz
Eine Menge Phosphatpuffer mit einer Menge von 10% Tween 80 (zu gleichen Teilen) mischen. Definieren Sie im Labor, wie viel Sie vorbereiten möchten.
-Verfahren
5 ml Phosphatpuffer mit einem Schraubverschluss (Bakelit) in ein steriles Reagenzglas geben.
Nehmen Sie mit einer Inokulationsschleife genügend Kolonien von Mycobacterium-Wachstum, die in Keilen ausgesät sind, und lösen Sie sich im Phosphatpuffer auf.
Decken Sie das Rohr ab, ohne den Faden zu fest anzuziehen. 20 bis 30 Minuten bei 68 ° C in ein Wasserbad legen. Entfernen und bei 22-25 ° C abkühlen lassen
Messen Sie 0, 5 ml des endgültigen Reagenz (Gemischs) ab und geben Sie es mit der kalten Lösung in das Röhrchen. Beobachten Sie die Bildung von Blasen oder nicht.
Es wird wie die vorherigen Techniken interpretiert.
Verwenden Sie
Wenn ein Wachstum von Kolonien in angereicherten Medien erhalten wird, sollten an den erhaltenen Kolonien eine Gram-Färbung und ein Katalase-Test durchgeführt werden. Dies wird den Mikrobiologen anleiten, welche Verfahren zur endgültigen Identifizierung zu befolgen sind.
Qualitätskontrolle
Verwenden Sie zur Beurteilung der ordnungsgemäßen Funktion des Wasserstoffperoxid-Reagenz frisch gezüchtete Kontrollstämme wie Staphylococcus aureus als Positivkontrolle und Streptococcus sp- Stämme als Negativkontrolle.
Eine andere Alternative, die als Positivkontrolle dient, besteht darin, einen Tropfen Wasserstoffperoxid auf den Blutagar zu geben. Die Erythrozyten haben Katalase. Daher kommt es zu einer Blasenbildung, wenn sich das Reagenz in gutem Zustand befindet.
Als Negativkontrolle kann ein Schokoladenagar verwendet werden, hier sind die Erythrozyten bereits lysiert und der Test ist negativ.
Einschränkungen
- Verwenden Sie keine alten Kulturen für den Test, da dies zu falschen Negativen führen kann.
- Vermeiden Sie die Entnahme von Kolonien aus Kulturen in Blutagar, wenn darauf geachtet wird, den Agar nicht zu berühren. Dieses Verfahren kann zu falsch positiven Ergebnissen führen, da Erythrozyten Katalase enthalten.
-Wenn Sie die Kolonie mit Platingriff einnehmen, kehren Sie die Reihenfolge des Vorgangs nicht um, da dies zu falsch positiven Ergebnissen führen kann. Dies liegt daran, dass Platin in der Lage ist, mit Wasserstoffperoxid zu reagieren, was zu einer Blasenbildung führt.
- Verwenden Sie das Wasserstoffperoxid-Reagenz nicht, wenn es zu alt ist, da das Reagenz sehr instabil ist und mit der Zeit zur Zersetzung neigt.
- Bewahren Sie das Wasserstoffperoxid-Reagenz lichtgeschützt und gekühlt auf, um Beschädigungen zu vermeiden.
- Führen Sie bei jeder Verwendung eine Qualitätskontrolle des Wasserstoffperoxid-Reagenz durch.
- Berücksichtigen Sie, dass bei 30% H 2 O 2 die Reaktionen stärker sind als bei 3% H 2 O 2 .
