Proteinase K: Eigenschaften, enzymatische Aktivität und Anwendungen

Proteinase K ist ein Enzym, das zur Gruppe der Serinproteasen gehört, dh an seinem aktiven katalytischen Zentrum eine Aminosäure Serin aufweist und die Funktion hat, Peptidbindungen durch Hydrolyse aufzubrechen. Dieses Enzym gehört wiederum zur Familie der Subtilisin-Proteine ​​(Peptidase S8).

Proteinase K hat ein Molekulargewicht (MW) von 28.900 Dalton und wurde 1974 erstmals aus Extrakten des Pilzes Engyodontium album, früher bekannt als Tritirachium album Limber, isoliert .

Es weist eine hohe proteolytische Kapazität auf, von der gezeigt wurde, dass sie in der Lage ist, das im Haar vorhandene Keratin abzubauen. Das Wort Keratin wird im Englischen "Keratin" geschrieben, daher wurde es "Proteinase K" genannt.

Aufgrund seiner hohen Fähigkeit, native Proteine ​​zu spalten, eignet sich dieses Enzym für verschiedene molekularbiologische Techniken. Es wird hauptsächlich zur Isolierung und Herstellung von Nukleinsäuren mit hohem Molekulargewicht (MW) verwendet.

Proteinase K setzt die Kern-DNA frei, zerstört die Proteine ​​und inaktiviert die RNasen und DNasen, das heißt, eliminiert die Nukleasen in den DNA- und RNA-Präparaten.

Andererseits wurde festgestellt, dass Proteinase K einige denaturierte native Proteine ​​hydrolysieren kann, was das Interesse der Forscher für ihre Verwendung bei der Untersuchung von Prionproteinen (PrP C) geweckt hat.

Trotz seiner hohen proteolytischen Wirksamkeit gibt es Proteine, die gegen die Wirkung von Proteinase K resistent sind. Unter ihnen gibt es einige abnormale Proteine, sogenannte Prionen (PrP Sc), die mit übertragbaren spongiformen Enzephalopathien assoziiert sind.

Eigenschaften der Proteinase K

Proteinase K hat eine Tertiärstruktur, die aus drei Schichten besteht, wobei ein β-Faltblatt aus sieben Ketten zwischen zwei Schichten von Helices liegt. Da es zur S8-Peptidase-Familie gehört, zeichnet es sich durch eine katalytische Triade im aktiven Zentrum aus, deren sequenzielle Reihenfolge (Asp, His und Ser) sie von anderen Peptidase-Familien unterscheidet.

Dieses Enzym aus der Gruppe der Serinproteasen ist durch Hydrolyse der Peptidbindungen nahe der Carboxylgruppe der aliphatischen und aromatischen Aminosäuren gekennzeichnet.

Andererseits kann es in Gegenwart bestimmter ätzender Substanzen wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Tris-HCL und EDTA wirken, die bei der Denaturierung von Proteinen helfen und dazu führen, dass diese ihre ursprüngliche Struktur verlieren.

Dies ist ein vorläufiger Schritt bei der Herstellung von Proteinen für die Elektrophoresetechnik. Der pH-Bereich, in dem Proteinase K wirkt, ist ziemlich breit (2, 0 bis 12, 0), mit einem optimalen pH-Wert zwischen 7, 5 bis 12, 0 und einem isoelektrischen Punkt von 8, 9. Es ist ersichtlich, dass es gegen einen sehr breiten pH-Bereich wirksam ist.

Ein weiteres Merkmal der Proteinase K ist ihre Stabilität bei hohen Temperaturen (50 - 60 ° C).

Enzymatische Aktivität

Proteinase K benötigt das Vorhandensein von Calciumionen, obwohl dies seine Aktivität nicht beeinträchtigt, wenn es für die Aufrechterhaltung seiner Stabilität wesentlich ist.

Damit die Proteinase K den vollständigen Aufschluss des Substrats durchführt, ist eine ungefähre Kontaktzeit zwischen 5 Minuten und 2 Stunden erforderlich.

In diesem Sinne verglichen Daza et al. Die Reinheit der DNA, die zu verschiedenen Zeiten der Exposition gegenüber Proteinase K erhalten wurde, und kamen zu dem Schluss, dass eine längere Inkubation (bis zu 24 h) die Qualität der DNA signifikant verbessert.

Nun kann in Bezug auf die Konzentration, die von dem Enzym Proteinase K in den verschiedenen Protokollen verwendet wird, gesagt werden, dass es sehr unterschiedlich ist.

Es kann in sehr geringen Konzentrationen (5 μg / ml) bis zu Konzentrationen von 500 μg / ml angewendet werden. Die häufigsten Arbeitskonzentrationen liegen jedoch zwischen 50 und 100 μg / ml, insbesondere für die Proteinverdauung und die Inaktivierung von Nukleasen. Für die Gewebebehandlung ist zwar eine Konzentration von 2 mg / ml erforderlich.

Anwendungen

Seine Anwendungen sind sehr breit und lassen sich wie folgt zusammenfassen:

-Es wird bei der Verdauung von Proteinen und der DNA-Extraktion mit verschiedenen Methoden verwendet, z. B .: Aussalzen, PK-SDS, Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), modifiziertes Kaliumacetat und Extraktion mit Natriumiodid.

-Inaktivierung von Nukleasen (RNasen und DNasen).

-In der Technik der In-situ- Hybridisierung (HIS), um die Freisetzung von Nukleinsäure zu unterstützen, zusätzlich zur Beseitigung unerwünschter Proteine.

-Modifikation von Proteinen.

-Auf dem Stand der Forschung, in verschiedenen Studien.

Vorteile von Proteinase K

Es wurden mehrere Vergleichsstudien mit DNA-Extraktionsverfahren unter Verwendung von Proteinase K durchgeführt, andere, die es nicht verwenden, und alle kommen zu dem Schluss, dass die Verwendung des Enzyms größere Vorteile bietet. Zu den Vorteilen zählen:

- Es wird DNA mit hohem Molekulargewicht, hoher Qualität und Reinheit erhalten.

-Die extrahierte DNA ist bis zu 3 Monate haltbar.

Die extrahierte DNA kann in den folgenden Techniken verwendet werden: Southern Blot, Polymerasekettenreaktion (PCR), Elektrophorese, unter anderem.

Proteine, die gegen Proteinase K resistent sind

Mehrere Untersuchungen haben ergeben, dass Prionen (abnormale PrPSc-toxische Proteine) von PrPC-Proteinen (nativ) unterschieden werden, weil sie gegenüber der Wirkung von Proteinase K resistent sind, während PrPC gegenüber ihrer Wirkung empfindlich ist.

Andere Autoren haben beschrieben, dass es in der Struktur von PrPSc empfindliche Teile gibt und andere, die gegen Proteinase K resistent sind. Beide Teile sind jedoch gleichermaßen toxisch und infektiös.

Andererseits isolierten Bastian und Mitarbeiter 1987 4 Proteine ​​mit 28, 30, 66 und 76 kda aus einer Spezies von Spiroplasma mirum . Alle waren gegen die Wirkung von Proteinase K resistent und reagierten auch mit einigen Prionen kreuzreagiert.

Es ist bekannt, dass diese Spezies Katarakte und wichtige neurologische Schäden verursachen kann. Aufgrund der wissenschaftlichen Erkenntnisse von Bastian wurde unter anderem versucht, diesen Mikroorganismus mit übertragbaren spongiformen Enzephalopathien in Beziehung zu setzen.

Die Ätiologie dieser degenerativen neurologischen Pathologie wird jedoch weiterhin Prionen zugeschrieben.

In diesem Sinne identifizierten und charakterisierten Butler und Mitarbeiter 1991 eine Klasse von 40-Kda-Proteinase-resistenten Proteinen aus zwei Stämmen von Mycoplasma hyorhinis. Dieser Erreger befällt Schweine und infiziert deren Gewebe. In diesem Fall trat jedoch keine Kreuzreaktion mit den getesteten Prionen auf.

Weitere Forschung ist erforderlich, um viele Unbekannte darüber aufzuklären.